來源： 《Skin Res Technol》

　　作者：李尚圭,  咸瑞允,  李珠熙,  張有珍

　　皮膚老化是皮膚密度和彈性下降的特征，是那些想要保持年輕外表的人普遍關心的問題。鋅-α2-糖蛋白 (ZAG) 由各種體液分泌，與脂肪分解有關，并被確定為特應性皮炎生物標志物。本研究評估了 ZAG 肽的潛力，它具有抗衰老等多種益處。

　　材料和方法

　　我們對眼眶周圍皺紋明顯的患者 ( n = 22)進行了為期 4 周的臨床試驗， 使用含 ZAG 肽的產品。分別使用 Cutometer Dual MPA580、Ultrascan 和 Antera 3D CS 評估產品對皮膚密度、彈性和眼眶周圍皺紋深度的影響。體外評估了 ZAG 肽對 UVB 處理的角質形成細胞的影響，以了解其對抗皮膚屏障功能受損、膠原蛋白降解和衰老的潛在機制。此外，分別使用細胞計數(shù)試劑盒測定和定量逆轉錄聚合酶鏈反應評估了 ZAG 肽對細胞活力以及衰老和皮膚屏障相關基因表達的影響。

　　結果

　　患者的皮膚密度和彈性均有所改善，眼眶周圍皺紋減少。此外，超過 85% 的患者對該產品的抗衰老效果感到滿意。此外，ZAG 肽可降低 SA-β-半乳糖苷酶染色，下調衰老相關基因，并上調 UVB 照射角質形成細胞中的皮膚屏障功能相關基因。

　　結論

　　我們的臨床和體外研究結果表明，ZAG 肽具有抗衰老作用并改善皮膚屏障功能，表明其作為對抗皮膚衰老和改善皮膚健康的治療劑具有良好的潛力。

　　1. 引言

　　皮膚老化是一個復雜且多因素的過程，受內在和外在因素的影響。1 隨著 年齡的增長，由于膠原蛋白、彈性蛋白和透明質酸的逐漸流失，皮膚會發(fā)生各種變化，如出現(xiàn)皺紋和干燥。2、3、4 內在 和 外在 因素 的結合會導致皮膚外觀隨著衰老而逐漸發(fā)生不可避免的變化。1隨著時間的推移，皮膚會變薄、彈性變差、更容易受傷。日曬、吸煙和其他生活習慣等環(huán)境因素也會影響皮膚老化。4 因此 ，預防或減緩由這些因素引起的衰老過程至關重要。

　　皮膚屏障對于維持皮膚水分和保護皮膚免受環(huán)境損害至關重要。5 在 衰老過程中，皮膚的天然物質（如膠原蛋白、彈性蛋白和透明質酸）會減少，從而削弱皮膚屏障。3 皮膚 屏障功能的下降會降低皮膚保護自身免受環(huán)境壓力源影響的能力，從而加速皮膚老化。皮膚老化和皮膚屏障損傷的惡性循環(huán)因無保護地暴露于環(huán)境污染物、紫外線輻射和刺激性清潔劑而加劇，這些都會增加氧化應激并加速皮膚老化。6 因此 ，使用可以增強和恢復皮膚屏障的產品和做法對于延緩過早衰老的跡象至關重要。

　　ZAG 是一種多學科蛋白質，已在各種人體液以及前列腺、肝臟和乳腺的上皮細胞中檢測到。7、8在 之前 的研究中，ZAG 治療在特應性皮炎誘發(fā)的小鼠模型中增強了絲聚蛋白 (Flg) 的 mRNA 表達 。 它降低了與經表皮失水 (TEWL) 和炎癥因子相關的基因的 mRNA 表達。9 此外 ，在正常人表皮角質形成細胞中通過 shRNA 降解ZAG mRNA 也被證明可以降低FLG表達，并且 ZAG 肽已被證明對皮膚健康有多種影響。9 盡管 ZAG 肽具有已證實的穩(wěn)定性和其他有益作用，但缺乏關于其對皮膚的抗衰老作用的詳細研究。因此，本研究旨在調查 ZAG 肽及其含肽產品對皮膚健康的抗衰老作用。

　　2.材料和方法

　　2.1. 參與者

　　本研究招募了 22 名眼眶周皺紋明顯的女性患者（35-60 歲）。排除標準為：有皮膚病治療史（例如填充劑、洗臉、紋身、肉毒桿菌和激光）、近期 3 個月內使用過與本研究中使用的類似產品、皮膚病變、過敏或超敏反應、傳染性皮膚病以及對藥物、化妝品或常規(guī)光照有不良反應。所有參與者都被要求每天兩次涂抹 Ato 修復清潔劑、Ato 修復乳液和 Ato 修復霜（含 ZAG 肽的 Ato 修復液；L&C Bio Inc.，韓國首爾），持續(xù) 4 周。

　　本研究遵照《赫爾辛基宣言》進行，并經全球醫(yī)學研究中心機構審查委員會（IRB）批準（IRB編號GMRC‐18614‐E1R）。試驗前，向所有受試者解釋產品的成分、副作用和益處，并獲得受試者的知情同意。

　　2.2 臨床療效評價

　　使用 Ato Repair Solutions 4 周后，分別在基線、第 2 周和第 4 周評估其臨床療效。使用 Cutometer Dual MPA580（德國科隆 Courage Khazaka electronic GmbH）、Ultrascan UC22（Courage + Khazaka electronic GmbH）和 Antera 3D CS（愛爾蘭都柏林 Miravex）、Tewameter TM300（Courage Khazaka electronic, GmbH）分別測量皮膚密度、皮膚彈性、眶周皺紋深度變化和 TEWL。還記錄了不良事件，并要求參與者在 4 周試驗結束時使用問卷調查對產品療效的滿意度進行評分（表S2）。問卷評估采用五分量表（非常滿意 = 5、滿意 = 4、稍微滿意 = 3、無變化 = 2、不滿意 = 1），3 分或以上視為陽性反應并作為結果呈現(xiàn)。

　　2.3. ZAG 肽與細胞培養(yǎng)

　　ZAG 肽（序列：EDWKQDSQLQKAREDIFMETLKDIVEYYND）購自 AbClon Inc.（韓國首爾）。人表皮角質形成細胞（KC；原代表皮角質形成細胞；正常；人；成人，PCS-200-011）細胞和人真皮成纖維細胞（HDF）購自 ATCC（美國弗吉尼亞州馬納薩斯）。KC 和 HFD 細胞分別在含有 KGM™ Gold SingleQuots™ 補充劑（Bullet Kit；Lonza）的 KBM™ Gold 基礎培養(yǎng)基（Lonza，瑞士巴塞爾）和含有 10%（v/v）胎牛血清（Gibco，美國紐約州大島）和 1% 青霉素-鏈霉親和素（Gibo）的杜氏改良 Eagle 培養(yǎng)基（Lonza，美國馬里蘭州沃克斯維爾）中培養(yǎng)。所有細胞均在 37°C 、5% CO 2、加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　2.4 細胞毒性測量

　　使用細胞計數(shù)試劑盒 8 (CCK-8；Dojindo，日本益城) 測量細胞毒性。將 KC 細胞 (5 × 10 4細胞/孔) 接種于 96 孔細胞培養(yǎng)板中并孵育 24 小時。以五種不同濃度 (0.25、0.5、1.0、2.0 和 4.0 μg/mL) 添加 ZAG 肽，或使用 UVB 燈 (BLX26，BIO-LINK-Crosslinker，F(xiàn)RA) 用紫外線 B (UVB) 照射細胞以誘導光衰老。使用 ELISA 微孔板讀數(shù)儀 (VersaMax；Molecular Devices，美國加利福尼亞州) 測量 450 nm 處的吸光度。

　　2.5. 衰老相關β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）分析

　　根據(jù)制造商的說明，使用衰老細胞組織化學染色試劑盒 (CS0030，Sigma-Aldrich) 測量 SA-β-Gal 活性。將 KC 細胞 (5 × 10 4細胞/孔) 接種于 6 孔板中，并用 100 mJ/cm 2紫外線照射和 2.0 µg/mL ZAG 肽處理。用磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 洗滌培養(yǎng)皿，并在室溫 (20-25°C) 下用固定緩沖液固定 7 分鐘。固定后，用 PBS 洗滌細胞三次并添加到染色混合物中。將染色的細胞在 37°C 下無 CO 2孵育過夜，然后使用顯微鏡 (BX43，Olympus，東京，日本) 觀察并使用 ImageJ 軟件 (美國馬里蘭州貝塞斯達國立衛(wèi)生研究院) 進行分析。

　　2.6. 定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）

　　使用 TRIzol試劑（Invitrogen，美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆）從培養(yǎng) 24 小時的 KC 細胞（對照；未處理，紫外線；100 mJ/cm 2 UVB，紫外線 + ZAG；100 mJ/cm 2 UVB + 2.0 µg/mL ZAG 肽）和培養(yǎng) 3 天的 HDF 細胞（對照；未處理，紫外線；10 J/m 2 UVA，紫外線 + ZAG；10 J/m 2 UVA + 2.0 µg/mL ZAG 肽）中提取總 RNA，并使用 NanoDrop 分光光度計（ThermoFisher Scientific，美國加利福尼亞州卡爾斯巴德）進行 RNA 質量控制。按照制造商的說明，使用 RNA 到 cDNA EcoDry Premix Kit（Takara Sake，美國加利福尼亞州伯克利）合成 cDNA。使用特異性引物對進行 qRT-PCR（表 1) 和 SYBR Green Master MIX (美國威斯康星州麥迪遜市 Promega 公司)。使用GAPDH作為管家基因來標準化 mRNA 表達水平，并使用 2‐ΔΔCt 方法估計相對 mRNA 表達水平。

　　2.7. 免疫熒光染色

　　將KC 細胞（2.5 × 10 4 個細胞/孔）接種于 4 孔腔式載玻片中并孵育 24 小時，然后用 UVB（10 J/cm 2）或 UVB（10 J/cm 2）+ ZAG 肽（2.0 µg/mL）處理。然后用 4% (w/v) 多聚甲醛（Cell Signaling Technology，美國馬薩諸塞州丹弗斯）在室溫下固定細胞 15 分鐘，再用 PBS 清洗三次。將固定的細胞與抗 loricrin（Abcam Cambridge，英國）或抗絲聚蛋白（Abcam）抗體在 4°C 下孵育過夜。此后，將載玻片清洗三次并在室溫下與 FITC 標記的二抗（山羊 pAb to Rb IgG-FITC；Abcam）孵育 2 小時。最后，用含有 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚的 VECTASHIELD 封固劑（美國加利福尼亞州伯林蓋姆的 Vector Laboratories Inc.）固定載玻片。使用激光掃描顯微鏡（德國耶拿的卡爾蔡司 LSM 700）獲取熒光圖像，并使用 ImageJ 軟件進行分析。

　　2.8. 數(shù)據(jù)分析

　　所有數(shù)據(jù)均以平均值±標準差或百分比表示。使用 Kolmogorov-Smirnov 檢驗來驗證正態(tài)性。使用 Friedman 檢驗或 Wilcoxon 符號秩或重復測量方差分析比較基線、第 2 周和第 4 周的數(shù)據(jù)，隨后使用 Bonferroni 校正進行事后分析。p值<0.05 被認為具有統(tǒng)計學意義。所有實驗室研究均重復進行三次（n≥3）。使用 SPSS 統(tǒng)計版本 25.0 軟件（IBM Corp.，美國紐約州阿蒙克）進行統(tǒng)計分析。

　　3.結果

　　3.1. 參與者特征

　　這項研究納入了 22 名年齡在 35 至 60 歲之間的亞洲女性，她們的眼睛周圍有明顯的皺紋?；颊咂骄挲g為 50 ± 5.31 歲。所有參與者都成功完成了研究，直到最后一次訪問，沒有人因不遵守規(guī)定而退出。試驗 4 周后，患者沒有報告任何不良事件。

　　3.2. 含ZAG肽的Ato修復液的臨床療效及安全性

　　使用 Ato 修復液 4 周后測量皮膚密度和彈性，結果顯示皮膚密度顯著增加（基線；11.18 ± 3.60%，第 2 周；13.45 ± 3.78%，第 4 周；14.32 ± 4.60%，重復測量方差分析， 和皮膚表面彈性 (R 2 ) (基線; 0.69 ± 0.06, 第 2 周; 0.72 ± 0.06, 第 4 周; 0.73 ± 0.06, 重復測量方差分析, 顯示了 TEWL 測量結果。根據(jù)應用周數(shù)，TEWL 低于基線（基線；18.281 ± 4.517，第 2 周；16.622 ± 3.095，第 4 周；14.700 ± 2.592，重復測量方差分析，p  < 0.05）。與基線（0.129 ± 0.034 毫米）相比，第 2 周（0.089 ± 0.030 毫米）和第 4 周（0.082 ± 0.026 毫米）的眶周皺紋深度（毫米）顯著減少[ p  < 0.025（= 5%/2）；Friedman 檢驗和事后 Wilcoxon 符號秩檢驗；所有參與者均回答了主題滿意度調查問卷。問卷調查對受試者的滿意度評分顯示，86%、86% 和 91% 的受試者對皮膚密度、皮膚彈性和眶周皺紋的改善分別給予滿意的評分，評分為 ≥ 3。研究期間沒有任何患者報告不良事件，也沒有患者因不良事件而退出研究。這些結果表明使用含 ZAG 肽的 Ato 修復液治療是安全的。

　　3.3. 評價ZAG肽對細胞毒性和細胞衰老的影響

　　用 2.0 μg/mL ZAG 肽和 100 mJ/cm 2 UVB 照射處理的 KC 細胞活力分別為 90.26 ± 4.76% 和 79.16 ± 11.67%（圖 3A,B因此我們在后續(xù)實驗中也沿用了這些處理條件。KC細胞中SA-β-半乳糖苷酶染色的代表性圖像如圖所示。 4AUVB 治療組 SA-β-半乳糖苷酶染色細胞比例 (36.79 ± 1.99%) 顯著高于對照組 (16.75 ± 1.62%) 。相反，ZAG肽治療減輕了UVB引起的衰老增加；SA-β-半乳糖苷酶染色細胞的比例顯著降低至23.68±2.70%。

　　接下來，我們評估了 ZAG 肽對細胞衰老相關基因表達的影響。qRT-PCR 分析顯示， UVB 照射組的p16、p21和p53的 mRNA 表達明顯高于對照組。然而，用 ZAG 肽處理 UVB 照射的 KC 細胞可顯著降低這些 mRNA 的表達水平。相反，UVB 照射會增加基質金屬蛋白酶 ( MMP ) 2和MMP9的表達，而用 ZAG 肽處理可顯著降低這些表達。與對照組相比，UVB照射組 的組織金屬蛋白酶抑制劑1（ TIMP1 ）的表達也降低，而ZAG肽治療后，這種表達得到改善。這些結果證實了ZAG肽治療因UVB照射而老化的KC細胞可能具有抗衰老作用。

　　3.4. ZAG肽的皮膚屏障改善效果的體外評價

　　使用免疫熒光染色和 qRT-PCR 評估 ZAG 肽改善皮膚屏障的潛力。結果表明，與對照組相比，UVB 照射組 的FLG染色強度降低相反，與 UVB 照射組相比，ZAG 肽治療組 的FLG染色強度顯著增加。 FLG的 mRNA 表達也觀察到了類似的結果。此外，用 ZAG 肽治療可改善 UVB 誘導的染色強度降低 和外皮蛋白 ( IVN )。這些結果表明，用ZAG肽治療可改善體外皮膚屏障功能。

　　4.討論

　　皮膚老化是一個復雜的過程，受內在和外在因素的影響。隨著年齡的增長，我們的皮膚逐漸失去膠原蛋白和彈性蛋白，而膠原蛋白和彈性蛋白對于維持皮膚密度至關重要， 10 導致皮膚變薄、彈性降低，從而導致皺紋、下垂和其他衰老跡象。皮膚密度是維持皮膚保持水分、愈合、再生和保護身體能力的決定性因素。11 因此 ，皮膚密度低會導致皮膚干燥，加速衰老跡象。我們的研究使用體外和臨床評估調查了 ZAG 肽對皮膚老化和屏障功能的影響。對眼眶周圍皺紋明顯的患者進行以 ZAG 肽為主要成分的 Ato 修復液的臨床評估顯示，它具有改善皮膚密度和彈性以及減少眼眶周圍皺紋深度的潛力。此外，使用 KC 細胞進行體外實驗，我們的結果表明 ZAG 肽使用安全，具有抗衰老和改善皮膚屏障的作用。這些結果表明 Ato 修復液是治療明顯眶周皺紋的有效抗衰老劑。

　　SA-β-半乳糖苷酶與動物細胞的衰老過程有關，被認為是皮膚衰老的主要原因之一。12 它 在膠原蛋白和構成皮膚細胞外環(huán)境的其他分子的分解中的作用導致皮膚衰老。13 在 本研究中，我們發(fā)現(xiàn)用 ZAG 肽治療可顯著降低 UVB 照射的 KC 細胞中 SA-β-半乳糖苷酶染色細胞的比例。這些結果表明 ZAG 肽有可能通過抑制 SA-β-半乳糖苷酶的活性來減少 KC 細胞中 UVB 照射引起的衰老。

　　p16、p21和p53與衰老和皮膚老化密切相關。p16 表達增加與膠原蛋白生成減少有關，從而導致老化皮膚中出現(xiàn)皺紋。14 p21 的表達與受損蛋白質的積累和衰老細胞的形成有關，從而導致與年齡相關的皺紋和皮膚彈性增加。15、16 先前 的研究表明，負責調節(jié)細胞周期進程和分化的p53的表達與細胞衰老和皺紋的形成 有關 。17、18、19我們的研究 結果 顯示，與 UVB 照射組相比，ZAG 肽治療組中這些基因的表達顯著降低，這表明 ZAG 肽對 KC 細胞衰老的減弱是通過抑制衰老相關基因 p16 、p21和p53的表達來實現(xiàn)的。

　　MMP2、MMP9和TIMP1也與導致皮膚老化的膠原蛋白降解有關。MMP2 和 MMP9 蛋白會降解蛋白質、膠原蛋白和彈性蛋白之間的界面，而這些界面決定了皮膚的結構強度。20、21 TIMP1 可 抵消MMP 的作用并保護皮膚結構。22 我們 在此證明 ZAG 肽降低了受 UVB 照射的 KC 細胞中MMP2和MMP9的表達并誘導了TIMP1的表達，這表明 ZAG 肽的抗衰老作用是通過調節(jié)這些基因來調節(jié)的。此外，皮膚老化是在含有 KC 和成纖維細胞的整個皮膚中發(fā)生的，UVA 照射加 ZAG 肽治療組的 MMP3、MMP9 和 p53 基因表達明顯低于 HDF 細胞的 UVA 照射組，這表明 ZAG 肽治療不僅對 KC 細胞而且對成纖維細胞都有抗衰老作用

　　皮膚屏障保護皮膚免受環(huán)境損害，如紫外線輻射和刺激性化學物質，并防止水分流失、免疫反應和炎癥。FLG 是形成皮膚屏障和防止水分流失的必需蛋白質，而 IVN 參與產生表皮脂質，有助于保持皮膚水分。23、24 我們 的 結果表明，ZAG 肽增加了 UVB 照射的 KC 細胞中FLG和 IVN 的染色強度，并增加了FLG和IVN的 mRNA 表達。這些發(fā)現(xiàn)表明 ZAG 肽具有改善皮膚屏障功能、減少皺紋和 TEWL 的潛力。

　　盡管這項研究對 ZAG 肽的潛在抗衰老作用提供了有希望的結果，但仍有幾個局限性需要考慮。首先，這項研究是使用體外實驗和臨床試驗進行的，樣本量相對較小。因此，需要進行更大規(guī)模、更多樣化人群的臨床試驗，以進一步驗證 ZAG 肽對抗皮膚衰老的功效。此外，ZAG 肽抗衰老作用的詳細機制仍不清楚，需要進一步研究才能充分了解所涉及的分子機制。最后，本研究重點關注了 ZAG 肽對皮膚屏障、膠原蛋白降解和衰老的影響。然而，尚未研究 ZAG 肽對皮膚衰老其他方面（如色素沉著和炎癥）的影響。

　　總之，我們的研究提供了證據(jù)，證明 ZAG 肽可能是一種有前途的皮膚老化治療劑。在臨床環(huán)境中，使用含有 ZAG 肽的 Ato 修復液可改善皮膚密度、彈性和皺紋。我們的體外實驗表明，ZAG 肽通過降低 SA-β-半乳糖苷酶的活性并通過抑制p16、p21和p53的表達減弱衰老誘導，對 KC 細胞發(fā)揮潛在的抗衰老作用。此外，ZAG 肽降低了MMP2和MMP9的表達并誘導了TIMP1的表達，這可能有助于其抗衰老作用。最后，ZAG 肽增加了FLG和IVN的表達，它們是皮膚屏障功能的重要組成部分?？傊鶕?jù) FLG 和 IVN 表達增加而改善的皮膚屏障，皮膚密度和彈性增加，TEWL 和皺紋減少。此外，在基因表達水平的結果中，衰老和皺紋相關基因得到改善。這些結果證明了我們想要提出的 ZAG 肽抗衰老機制。然而，驗證我們的研究結果以探索 ZAG 肽的治療益處并了解其抗衰老作用的確切機制仍需要進一步研究。

　　原始出處：

　　Lee SG, Ham S, Lee J, Jang Y, Suk J, Lee YI, Lee JH. Evaluation of the anti-aging effects of Zinc-α2-glycoprotein peptide in clinical and in vitro study. Skin Res Technol. 2024 Mar;30(3):e13609. doi: 10.1111/srt.13609. PMID: 38419415; PMCID: PMC10902615.

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